Mikrobiologické vlastnosti kmenů endogenní vaginální flóry asymptomatických žen reprodukčního věku


Microbiological properties of endogenous vaginal flora strains in asymptomatic women of childbearing potential.

Vaginal ecosystem is a complex system with intricate regulation that acts as a vaginal protection against exogenous infection. The complex nature of vaginal microenvironment and persisting therapeutic dilemmas incidental to treatment of women with chronic disturbance of vaginal ecosystem are the subject to research into vaginal flora aiming to compose a new therapeutic agent for restoration and stabilization of vaginal eumicrobia. During the experimental phase of the research, 35 samples –  vaginal smears from asymptomatic women of childbearing potential –  were examined. Bacterial strains were accurately identified and, following assessment of growth curves and vitality, ten bacterial strains were selected for further detailed examination of their specific characteristics. The research focused on testing of immunomodulatory activity (determination of fagocytary activity, fagocytosis index, lysozyme activity and peroxidase activity), bactericidal and candidacidal activity of the selected strains, ability to adhere to epithelial cells (lipophilicity testing), assessment of strain sensitivity to antibiotics (antibiogram) and determination of lactic acid and hydrogen peroxide production. Following detailed assessment, the following strains are considered to be ideal components of a probiotic preparation: 16A/ 1 Lactobacilus fermentatum (ideal immunostimulatory effects, high bactericidal and candidacidal activity), strain 17A Lactobacillus crispatus, 29B Lactobacillus acidophilus (stimulation of leukocyte fagocytary and leukocyte peroxidase activity) and strain 8A Lactobacillus gasseri (high antibacterial resistance). The effects of the optimal combination of endogenous vaginal flora probiotic strains in the treatment of vaginal infections and in restoring and stabilizing vaginal environment in the form of a new probiotic vaginal preparation will be tested in a subsequent clinical study.

Keywords:
vaginal ecosystem –  endogenous vaginal flora –  growth curve –  lyophilization –  bacterial strain vitality –  immunomodulatory properties –  hydrophobicity –  bactericidal and candidacidal activity –  antibiograms


Autoři: R. Krajčovičová 1;  R. Hudeček 1;  M. Chrápavá 2
Působiště autorů: Gynekologicko‑porodnická klinika LF MU a FN Brno 1;  Valosun a. s., oddělení výzkumu a vývoje, Brno 2
Vyšlo v časopise: Prakt Gyn 2009; 13(4): 192-201

Souhrn

Vaginální ekosystém je komplexní a složitě regulovaný systém, který slouží na ochranu pochvy před vstupem infekce. Komplexní problematika poševního mikroprostředí a přetrvávající terapeutické rozpaky při léčbě žen s chronicky porušeným vaginálním ekosystémem jsou předmětem výzkumu vaginální flóry s cílem vytvoření nového terapeutického preparátu na obnovu a stabilizaci poševní eumikrobie. V experimentální etapě bylo vyšetřeno 35 vzorků –  vaginálních stěrů asymptomatických žen reprodukčního věku. Vzorky bakteriálních kmenů byly přesně identifikovány a po zhodnocení růstových křivek a vitality bylo vybráno deset bakteriálních kmenů, jejichž specifické vlastnosti byly dále podrobně testovány. Výzkum se zaměřil na testování imunomodulační aktivity (stanovení fagocytové aktivity, fagocytového indexu, lysozymové aktivity a peroxidázové aktivity), baktericidní a kandidacidní aktivity vybraných kmenů, schopnost adherence k epiteliálním buňkám (metoda testování lipofility), stanovení odolnosti kmenů vůči ATB (antibiogram) a stanovení produkce kyseliny mléčné a peroxidu vodíku. Po absolvování detailního testování je za ideální součást generovaného probiotického preparátu považován kmen 16A/ 1 Lactobacilus fermentatum (ideální imunostimulačními účinky, vysoká baktericidní a kandidacidní aktivita), kmen 17A Lactobacillus crispatus, 29B Lactobacillus acidophilus (stimuluce fagocytární a peroxidázové aktivity leukocytů) a kmen 8A Lactobacillus gasseri (vysoká rezistence vůči ATB). Testování optimální kombinace probiotických kmenů endogenní vaginální flóry v terapii poševních infekcí a při obnovení a stabilizaci poševního prostředí v novém probiotickém vaginálním preparátu bude předmětem následného klinického hodnocení.

Klíčová slova:
vaginální ekosystém –  endogenní poševní flóra –  růstová křivka –  lyofilizace –  vitalita bakteriálních kmenů –  imunomodulační vlastnosti –  hydrofóbnost –  baktericidní a kandidacidní aktivita –  antibiogramy

Úvod

Vaginální ekosystém je komplexní a složitě regulovaný sytém, který citlivě reaguje i na minimální změny endogenních nebo exogenních podmínek. Představuje přirozenou ochranu genitálního ústrojí ženy před rozvojem a rozšířením zánětlivých onemocnění. Je tvořen řadou složek, které jsou ve vzájemné dynamické rovnováze. Jestliže se změní jeden faktor systému, jsou ovlivněny i zbývající jeho součásti [1]. K základním součástem poševního ekosystému patří:

  • poševní sliznice a slizniční imunitní systém
  • dynamika hormonálních hladin menstruačního cyklu
  • endogenní poševní flóra
  • kyselé poševní pH

Klíčovým konceptem pro pochopení mikroekologie pochvy je ta skutečnost, že kolonizovaná tkáň vytváří prostředí pro kolonizující mikrobiální flóru. Druhové složení a hustota populace mikrobiální flóry je obrazem fyzikálních a chemických vlastností kolonizované tkáně. Z této skutečnosti vyplývá, že změna existujících podmínek tkáně vede k alteraci flóry ve smyslu množství a druhového zastoupení. Další vztahy, které ovlivňují poševní eumikrobii vznikají při vstupu exogenních organizmů do hostitelské tkáně. Exogenní mikroorganizmy soutěží s endogenními mikroby o kolonizaci poševní sliznice, a to na buněčné a molekulární úrovni [2]. Vaginální ekosystém je rovněž pod vlivem řady variabilních faktorů, které patří k exogenním nebo endogenním mechanizmům.

Celosvětově probíhající studie se zaměřují především na zkoumání faktorů, které se podílí na poruše poševního prostředí a samy nebo v kombinaci vedou ke vzniku poševních infekcí. Nepříznivě působí špatný celkový zdravotní stav, celková nebo lokální aplikace různých léčiv, hormonální nerovnováha v průběhu menstruačního cyklu a těhotenství a nesprávné hygienické návyky. Na hladině významnosti p = 0,001 bylo jasně prokázáno, že porucha vaginální mikroekologie nezávisle souvisí s kouřením, sexuální promiskuitou, opakovaným nechráněným pohlavním stykem, vaginálním stykem po análním styku, sexuální praxí s mužem bez cirkumcize, nedostatkem H2O2 produkujících laktobacilů a přítomností HSV 2 sérových protilátek [3] (tab. 1). Hormonální orální kontracepce a používání prezervativů signifikantně snižují výskyt bakteriální vaginózy. V protikladu aplikace nitroděložního tělíska (IUD) vede k signifikantnímu nárůstu výskytu bakteriální vaginózy [4]. Porušení ekologické rovnováhy poševního prostředí vede k přemnožení patogenních mikroorganizmů. Výsledkem těchto mechanizmů je zánět pochvy, který je jedním z nejčastějších onemocnění sexuálně aktivních žen. Zásadním problémem gynekologie jsou recidivující a komplikované vaginální infekce, které mívají vážné zdravotní následky s dopadem na plodnost a kvalitu života postižených žen. Patofyziologické mechanizmy těchto stavů spočívají v rozpadu poševní mikroekologie. Při řešení tohoto problému je nutný komplexní pohled na fungování vaginálního ekosystému. Spočívá v důsledné diagnostice a terapii akutní infekce s následnou dlouhodobou terapií, která opětovně obnoví fungování poševního mikroprostředí [5]. Dlouhodobá lokální aplikace nízkých dávek estrogenů v kombinaci s lokálním podáním živých probiotických kmenů laktobacilů přináší pozitivní výsledky v řešení poševních dysmikrobií [6].

Tab. 1. Souhrn multivariabilní logistické regresní analýzy faktorů asociovaných se vznikem bakteriální vaginózy.
Souhrn multivariabilní logistické regresní analýzy faktorů asociovaných se vznikem bakteriální vaginózy.
* v posledních 4 měsících, ** zjištěno při první návštěvě

Přetrvávající terapeutické rozpaky při léčbě žen s chronicky porušeným vaginálním mikrobiálním prostředím jsou podnětem pro výzkum vaginálního ekosystému. Cílem tohoto výzkumného záměru, na jehož řešení se podílí celá řada specialistů a odborných institucí, je analýza individuálních mikrobiologických vlastností jednotlivých probiotických kmenů vaginální endogenní flóry asymptomatických žen v reprodukčním věku s následným klinickým hodnocením optimální kombinace probiotických kmenů. Cílem je vytvoření optimálního probiotického vaginálního preparátu na obnovu a stabilizaci poševního prostředí [7].

Název projektu: Uplatnění probiotických kmenů při urogenitálních onemocněních

Název programu: Dotační program Impuls, FI IM5/ 205

Instituce zapojené do výzkumu:
Gynekologicko porodnická klinika Lékařské fakulty Masarykovy Univerzity v Brně a Fakultní nemocnice Brno
Přírodovědecká fakulta Masarykovy Univerzity v Brně
Farmaceutická fakulta Univerzity Komenského v Bratislavě
Ústav chemie potravin a biotechnologií Fakulty chemické VUT v Brně
Valosun, a. s., Brno
Chemila spol. s r. o., Hodonín

Cíl práce

Analýza individuálních mikrobiologických vlastností jednotlivých probiotických kmenů vaginální endogenní flóry asymptomatických žen  v reprodukčním věku z pohledu vitality po lyofilizaci individuálních kmenů a v symbióze, hodnocení baktericidní a kandidacidní aktivity, hodnocení produkce kyseliny mléčné a peroxidu vodíku, hodnocení adherence k vaginálnímu epitelu a analýza odolnosti vůči antibiotikům. Dále hodnocení imunomodulačních vlastností individuálních kmenů a kmenů v symbióze.

Materiál

V období leden až březen 2009 bylo získáno celkem 35 vzorků vaginálních stěrů asymptomatických zdravých žen ve věku 20– 40 let bez jakékoliv medikace. Vaginální stěry byly prováděny v periovulačním období menstruačního cyklu. Ženy ve sledovaném souboru neměly před odběrem materiálu nechráněný pohlavní styk. Do souboru nebyly zařazeny ženy, které užívaly v posledních 14 dnech antibiotika. Ze sledovaného souboru byly vyloučeny uživatelky hormonální antikoncepce.

Metodika

Odběr vaginálních stěrů

Vzorky vaginálních stěrů byly odebírány na ambulantních pracovištích gynekologicko porodnické kliniky LF MU a Fakultní nemocnice Brno. Vzorky byly odebírány na vatový tampon, který byl uložen do transportního média, které udržovalo životaschopnost bakterií ve vzorku, zabraňovalo během transportu jejich přerůstání doprovodnou mikroflórou a udržovalo tak kvantitativní poměry mezi jednotlivými mikrobními druhy. Vzorky byly do hodiny po odběru dopraveny do laboratoře České sbírky mikroorganizmů při Masarykově Univerzitě v Brně k dalšímu zpracování.

Zpracování vzorků

Růst bakterií na živných půdách

Vzorky byly z vatového tamponu za přísně sterilních podmínek očkovány a kultivovány na M.R.S. agaru (název agaru dle objevitelů –  de Man, Rogosa and Sharpe) (anaerobně i v CO2) a v M.R.S. bujonu. Nejlepší růst byl pozorován v bujonu (24 hod při 37 °C), nejslabší pak na agaru v CO2 atmosféře. Morfologicky odlišné kolonie byly přeočkovány na M.R.S. agar nebo na BHI agar. Na M.R.S. agar byly přeočkovány kolonie pro makroskopickou morfologii (= charakteristika kolonií), na BHI agar pak kolonie pro alkalickou lyzi pro rep PCR techniku. Byla provedena mikroskopie a katalázový test.

Lyofilizace vzorků

Lyofilizace (sušení vymrazováním) je nejšetrnější metodou přípravy suchých látek. Metoda má tři fáze. Nejprve se vlhký materiál zmrazí a následně se ve dvou krocích suší. Jestliže je vysušovaná látka úplně zbavena „volné“, tj. veškeré chemicky nevázané vody, může se za vysokého vakua docílit i oddělení krystalické vody. Tato část procesu vysušování látky se označuje jako dosušování. Po druhém sušení v materiálu zůstává okolo 1– 4 % vody.

Izolované kultury kultivačně dominantních kmenů byly lyofilizovány. Dvě ampulky každého lyofilizovaného kmene jsou uloženy na pracovišti České sbírky mikroorganizmů, tři ampulky byly po kontrole čistoty a životaschopnosti bakterií odeslány na pracoviště při Farmaceutické fakultě UK v Bratislavě, kde následují další testy: vitalita probiotických kmenů po lyofilizaci, stanovení růstových křivek jednotlivých probiotických kmenů, stanovení imunomodulační aktivity (stanovení fagocytové aktivity, fagocytového indexu, lysozymové aktivity a peroxidázové aktivity) vybraných probiotických kmenů, stanovení baktericidní a kandidacidní aktivity vybraných kmenů, adherence k epiteliálním buňkám (metoda testování lypofility), stanovení odolnosti kmenů vůči antibiotikům (antibiogram), stanovení produkce kyseliny mléčné a peroxidu vodíků, produkce bakteriocinů.

Identifikace lyzátů dominantních bakteriálních kmenů

Rep PCR identifikace lyzátů

Laboratorní metodou rep PCR (repetitive sequence based PCR) se stanovuje DNA agens v biologickém materiálu. Využívá se procesu amplifikace DNA, s jejíž pomocí lze zmnožit a rozlišit vybranou sekvenci DNA. Metoda je vysoce selektivní, což umožňuje stanovení požadovaného agens i při kontaminaci jinými mikroorganizmy. Pro stanovení není nutný živý mikroorganizmus, ale je nutná neporušená DNA mikroorganizmu. Rep PCR test lze použít v klinické laboratoři ke stanovení DNA bakterií, virů, plísňových a jiných infekcí. Tato metoda našla uplatnění jak pro identifikaci, tak pro vnitrodruhovou typizaci širokého spektra grampozitivních i gramnegativních bakterií.

Metodou rep PCR byla provedena suspektní identifikace jednotlivých kultivačně dominantních kmenů s vysokou vitalitou a růstovou aktivitou. Ve všech případech se jednalo o mikroaerofilní mléčné bakterie, které se v jednotlivých vzorcích vyskytovaly povětšinou v monokultuře. K detailnímu určení jednotlivých vybraných izolovaných kmenů byla využita genotypizace metodou ribotypizace (RiboPrinter) a biochemická identifikace (API 50 CH, konvenční testy).

Biochemická identifikace lyzátů

Do detailní identifikace metodami ribotypizace (RiboPrinter) a biochemickou identifikací (API 50 CH) bylo zařazeno 26 izolovaných kmenů, které byly suspektně identifikovány jako Lactobacillus sp. Dále byla provedena biotypizace pomocí komerční soupravy mikrotestů API 50CH i několika konvenčních testů. Na základě dosažených výsledků byla většina z těchto kmenů zařazena do „komplexu Lactobacillus acidophilus“.

Ribotypizace systémem RiboPrinter

Za účelem podrobné molekulárně biologické klasifikace vybraných kultur presumptivních laktobacilů byla provedena ribotypizace automatizovaným systémem RiboPrinter. Tento systém umožňuje jak vnitrodruhovou typizaci jednotlivých bakteriálních kultur, tak i mezidruhovou identifikaci. Výsledky provedené ribotypizace charakterizuje vysoká variabilita genotypu těchto kultur (obr. 1).

Výsledky ribotypizace (Ribo-printer).
Obr. 1. Výsledky ribotypizace (Ribo-printer).

Na základě podrobné analýzy výsledků metody rep PCR, ribotypizace (RiboPrinter) a biochemické identifikace (API 50 CH) bylo popsané celkové spektrum bakteriálního osídlení vaginálního prostředí zdravých symptomatických žen reprodukčního věku sledovaného souboru. Analyzované kmeny patří většinou do „komplexu Lactobacillus acidophilus“ (tab. 2).

Tab. 2. Výsledky identifikace lyzátů po analýze metod rep-PCR, API 50CH a RiboPrinter.
Výsledky identifikace lyzátů po analýze metod rep-PCR, API 50CH a RiboPrinter.

Výsledky

Stanovení růstových křivek a vitality jednotlivých kmenů

Růstová křivka

Bakteriální kultura testovaných kmenů vykultivovaná na M.R.S. agaru byla naočkována do tekutého růstového média M.R.S. bujonu. Spektrofotometricky měří absorbance v jednotlivých vzorcích proti čistému médiu při vlnové délce 540 nm do dosažení vrcholu exponenciálního růstu. V průběhu měření se bakteriální kultura udržuje. Z hodnot absorbance se stanoví růstová křivka.

Ve sledovaných vzorcích nejlépe rostou kmeny 02C, 08A (obr. 5), 12D, 13A, 16A/ 1 (obr. 2), 17A (obr. 3), 18C, 29A, 29B (obr. 4), 31A, které po naočkování nejrychleji dosáhly vrcholu exponenciálního růstu. Rychlost růstu je z pohledu průmyslové výroby podstatným ukazatelem. Kmeny 5D, 6A, 10E/ 1 26A, 27A, 30C, 32A a 35A byly při dalších testech vyloučeny. Kmeny 5D, 6A, 26A, 27A, 30C, 32A a 35A z důvodu velmi slabého růstu (až 3 dny), kmen 10E/ 1 z důvodu pozorované kontaminace kvasinkami.

Kmen 16A/1 Lactobacillus fermentum.
Obr. 2. Kmen 16A/1 Lactobacillus fermentum.

Kmen 17A Lactobacillus acidophilus/crispatus.
Obr. 3. Kmen 17A Lactobacillus acidophilus/crispatus.

Kmen 29B Lactobacillus acidophilus.
Obr. 4. Kmen 29B Lactobacillus acidophilus.

Kmen 08A Lactobacillus gasseri.
Obr. 5. Kmen 08A Lactobacillus gasseri.

Zastoupení jednotlivých kmenů rodu Lactobacillus.
Graf 1. Zastoupení jednotlivých kmenů rodu Lactobacillus.

Do dalších testů byly dle optimální růstové křivky zařazeny kmeny Lactobacillus gasseri

02C, 08A, 12D, 13A, Lactobacillus fermentum 16A/ 1, Lactobacillus crispatus 17A, Lactobacillus crispatus 18C, Lactobacillus acidophilus 29B a Lactobacillus jensenii 29A, 31A.

Vitalita jednotlivých kmenů

Vitalita bakteriálních kmenů je při vývoji probiotického terapeutického preparátu jedním z nejdůležitějších kritérií. Lyofilizáty jednotlivých testovaných kmenů suspendují ve fyziologickém roztoku (pH 7,2) a získaná suspenze se naředí fyziologickým roztokem v geometrické řadě. Z každého ředění se nanese vzorek na desky s M.R.S. agarem a po inkubaci v atmosféře 5 % CO2 se vyberou ředění s počitatelným množstvím kolonií (20 až 200 kolonií). Kolonie se spočítají a vypočítá se počet živých buněk na 1 g lyofilizátu jednotlivých kmenů.

Na základě stanovení vitality lyofilizátů byly zjištěny rozdíly ve vitalitě jednotlivých kmenů. Nejlepší vitalitu vykázaly kmeny 18C Lactobacillus crispatus a 16A/ 1 Lactobacillus fermentum (108/ ml). Dobrou vitalitu vykázal i kmen 13A Lactobacillus gasseri (107/ ml). Slabou vitalitu vykázaly kmeny 29A a 31A Lactobacillus jensenii (graf. 2).

Stanovení vitality jednotlivých kmenů po lyofilizaci.
Graf 2. Stanovení vitality jednotlivých kmenů po lyofilizaci.

Stanovení specifických a nespecifických imunitních vlastností jednotlivých kmenů

Stanovení imunomodulační aktivity jednotlivých kmenů

Důležitou vlastností jednotlivých bakteriálních kmenů osídlujících pochvu zdravé ženy jsou jejich imunomodulační vlastnosti. V prostředí zdravé poševní flóry je prostřednictvím nespecifické imunitní kaskády zvyšována imunitní aktivita leukocytů, zefektivňuje se jejich fagocytární schopnost a zvyšuje se lysozymová a peroxidázová aktivita. Tím poševní flóra, zastoupená zejména lactobacily, nespecificky přispívá k zlepšení obranyschopnosti vaginální sliznice vůči patogenům a omezuje výskyt kolpitid.

Nejlepší imunostimulační účinky na nespecifickou imunomodulační aktivitu lidských leukocytů vykázal ve sledovaných vzorcích kmen 16A/ 1 Lactobacillus fermentum, který stimuloval všechny aktivity na 99,9 %. Všechny ostatní kmeny aktivitu lysozymu snižovaly. Ve sledovaných vzorcích všechny kmeny vykázaly imunomodulační aktivitu. Kmeny, které nevykázaly statistické zvýšení fagocytové aktivity, vykázaly na druhé straně zvýšený fagocytový index a kmeny, které neaktivovaly leukocyty ke zvýšené lysozymové aktivitě, je aktivovaly ke zvýšené peroxidázové aktivitě.

Adherence k epitelovým buňkám vybraných kmenů

Důležitou vlastností endogenní poševní flóry je komplexní interakce mezi hostitelem a mikroorganizmem a interakce mezi jednotlivými bakteriálními druhy jak endogenními, tak exogenními. Některé z těchto interakcí jsou významné při vzniku poševních infekcí. Interakce mezi mikrobiálními druhy mohou být synergické nebo antagonické. Důležitým antagonistickým vztahem mezi mikroorganizmy poševní flóry je kompetice patogenů s fyziologickou bakteriální flórou a receptory. Přítomnost laktobacilů a jejich shlukování zabraňuje a blokuje adhezi patogenních kmenů na povrchové slizniční receptory. Redukce normální poševní flóry může vyvolat mikrobiální nerovnováhu, jejímž důsledkem je vznik infekce [2].

Kmeny, které dosahují hydrofóbnost vyšší než 30 až 35 %, se považují za dostatečně adherentní k epitelovým buňkám. Všechny kmeny dosáhly hydrofóbnost vyšší než 50 % kromě kmenu 29A Lactobacillus jensenii, který dosáhl hydrofóbnost jen 6,49 % a není lipofilní (graf. 3).

Adherence k epitelovým buňkám vybraných kmenů.
Graf 3. Adherence k epitelovým buňkám vybraných kmenů.

Produkce kyseliny mléčné vybranými kmeny rodu Lactobacillus

Kyselé poševní pH je důležitým aspektem, který ovlivňuje hustotu a složení poševní flóry. Hlavním mechanizmem, který zajišťují stabilní kyselé poševní pH, je kontinuální štěpení glykogenu na kyselinu mléčnou vlivem laktobacilů. Kyselé poševní pH napomáhá stabilnímu osídlení poševní flóry, ovlivňuje mnohé enzymatické systémy a má vliv na rozpustnost živin a kovů [2].

Všechny sledované kmeny produkují kyselinu mléčnou. Nejvíc kyseliny mléčné produkuje kmen 17A Lactobacillus crispatus a nejméně kyseliny mléčné produkuje kmen 31A Lactobacillus jensenii. Kmeny 29A, 08A, 29B, 13A, 02C, 16A/ 1 produkují srovnatelné množství kyseliny mléčné s kmenem 17A bez statisticky významných rozdílů. Kmeny 12D a 18C produkují méně kyseliny mléčné na hladině významnosti p < 0,005 a kmen 31A na hladině významnosti p < 0,01 (graf. 4).

Stavení produkce kyseliny mléčné vybraných kmenů rodu lactobacilus.
Graf 4. Stavení produkce kyseliny mléčné vybraných kmenů rodu lactobacilus.

Produkce peroxidu vodíku vybranými kmeny rodu Lactobacillus

Další z důležitých nespecifických imunitních protektivních vlastností lactobacilů je schopnost produkce peroxidu vodíku. Multivariabilní logistická regresní analýza faktorů asociovaných se vznikem bakteriální vaginózy na hladině významnosti p = 0,001 jasně prokázala, že bakteriální vaginóza nezávisle souvisí kromě jiného i s nedostatkem H2O2 produkujících laktobacilů [3].

Všechny sledované kmeny produkují peroxid vodíku. Nejvíc H2O2 produkuje po 10 hod kmen 29A Lactobacillus jensenii a nejméně H2O2 produkuje kmen 29B Lactobacillus acidophilus, i když po 30 min se projevil jako třetí nejproduktivnější kmen. Kmen 2C Lactobacillus gasseri po 30 min produkoval nejméně H2O2, ale po 10 hod byl čtvrtý nejproduktivnější kmen. Tato skutečnost je z pohledu dlouhodobého antimikrobiálního působení na povrchu vaginální sliznice důležitější než rychlá a krátkodobá produkce do 30 min (graf 5,6).

Stanovení H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; v supernatantě po 30 min kultivace.
Graf 5. Stanovení H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> v supernatantě po 30 min kultivace.

Stanovení H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; v supernatantě po 10 hod kultivace.
Graf 6. Stanovení H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> v supernatantě po 10 hod kultivace.

Baktericidní a kandidacidní aktivita vybraných bakterií rodu Lactobacillus

Baktericidní a kandidacidní aktivita poševních laktobacilů je důležitým faktorem interakce mezi jednotlivými bakteriálními druhy.

Všechny sledované kmeny vykázaly baktericidní aktivitu vůči Staphylococcus aureus ATCC 6 538 a Escherichia coli ATCC 11 229 a 5 kmenů vykázalo kandidacidní aktivitu proti Candida albicans CCM 8 186. Mikrobicidní aktivitu na všechny testované patogenní mikroorganizmy vykázalo celkem 5 kmenů: Lactobacillus fermentum 16A/ 1, Lactobacillus crispatus 17A, Lactobacillus jensenii 29A a Lactobacillus acidophilus. 29B, Lactobacillus jensenii 31A (graf 7).

Mikrobicidní aktivita vaginálních laktobacilů vůči patogenům.
Graf 7. Mikrobicidní aktivita vaginálních laktobacilů vůči patogenům.

Citlivost sledovaných kmenů na antibiotika

Na testování odolnosti jednotlivých kmenů vůči antibiotikům (ATB) se použilo 13 druhů antibiotických disků. Referenční kmen S. aureus CCM 2 022 byl citlivý na všechna antibiotika. Rezistence laktobacilů na ATB je výhodou v případě antibiotické terapie infekce v organizmu. Nejvyšší rezistenci vůči ATB vykázal kmen 08 Lactobacillus gasseri, který byl rezistentní vůči 11 ATB, citlivý na 1 ATB a semirezistentní též na 1 ATB. Největší citlivost vykázaly kmeny 18C Lactobacillus crispatus, 29A Lactobacillus jensenii a 31A Lactobacillus jenseni, které byly rovněž citlivé na 8 ATB a rezistentní na 5 antibiotik. (tab. 3).

Tab. 3. Stanovení citlivosti zkoumaných laktobacilů na vybrané ATB.
Stanovení citlivosti zkoumaných laktobacilů na vybrané ATB.
PNC – penicilin, AMP – ampicilin, OX – oxacilin, CAZ – ceftazidin, CTX – cefotaxim, VA – vankomycin, CN – gentamicin, TOB – tobramycin, OFX – ofloxacin, CIP – ciprofloxacin, TE – tetracyklin, E – erytromycin, DA – klindamycin, C – citlivý, R – rezistentní, SC – středně citlivý

Diskuze

Cílem výše uvedeného výzkumu je vytvoření nového optimálního vaginálního probiotiockého preparátu. Nový preparát by měl být vytvořený v návaznosti na klinické hodnocení kombinace probiotických kmenů z pohledu jejich vitality po lyofilizaci, baktericidní a kandidacidní aktivity, produkce kyseliny mléčné, peroxidu vodíku, adherence k vaginálnímu epitelu, odolnosti vůči ATB a jejich imunomodulačních vlastností. Takový preparát bude určen k terapii poševních infekcí a k obnovení a stabilizaci vaginálního ekosystému. A to především u žen dlouhodobě neúspěšně léčených pro poruchy poševního prostředí. Tedy u pacientek s výskytem recidivující nebo chronické vulvovaginitidy, recidivující bakteriální vaginózy nebo kandidózy, s nálezem chronický poševní fluór nejasné etiologie.

Ideální vaginální probiotikum by všeobecně mělo obsahovat bakteriální kmeny s ideálními vlastnostmi –  jejich růstové křivky by měly být strmé, bakterie by měly být vysoce vitální, měly by stimulovat fagocytární aktivitu leukocytů, aktivovat lysozym a peroxidázu, měly by být vysoko adherentní k poševnímu epitelu, měly by produkovat dostatečné množství kyseliny mléčné a peroxidu vodíku. Měly by se vyznačovat vysokou baktericidní a kandidacidní aktivitou a měly by být rezistentní na antibiotika. V ideálním probiotiku jsou jednotlivé bakterie ve vzájemné symbióze a navzájem potencují své schopnosti. Ideální probiotikum by mělo být dobře tolerované pacientkou, mělo by se jednoduše aplikovat a jeho výrobní cena by měla být co nejnižší.

Ve sledovaném souboru jsme studovali celkem 50 bakteriálních kmenů získaných od 35 zdravých symptomatických žen reprodukčního věku. Při hodnocení růstových křivek došlo k prvnímu odfiltrování kmenů, protože rychlost růstu je z pohledu průmyslové výroby podstatným ukazatelem. Dle růstových křivek nejlépe rostly kmeny 02C, 08A (obr. 5), 12D, 13A, 16A/ 1 (obr. 2), 17A (obr. 3), 18C, 29A, 29B (obr. 4), 31A, které po naočkování nejrychleji dosáhly vrcholu exponenciálního růstu. Tyto kmeny byly proto zařazeny do následního detailního testování. Ostatní kmeny byly z důvodu slabého růstu z dalších testů vyloučeny.

Po absolvování detailního testování mikrobiologických vlastností se jako nejideálnější bakteriální kmen jeví jednoznačně kmen 16 A/ 1 Lactobacilus fermentatum (obr. 2). Jde o kmen, který při testování prokázal vysokou vitalitu. Dále byly prokázány jeho výjimečné imunostimulační účinky na nespecifickou imunomodulační aktivitu lidských leukocytů. Jako jediný kmen stimuloval všechny aktivity leukocytů (fagocytární aktivitu, lyzozýmovou a peroxidázovou aktivitu) až na 99,9 %. Byla prokázána jeho vysoká adherence na epitel, vysoká produkce kyseliny mléčné a vysoká produkce peroxidu vodíku po 30 min kultivace. Kmen 16 A/ 1 Lactobacilus fermentatum dále vykázal mikrobicidní aktivitu na všechny testované patogenní mikroorganizmy (E. colli, Safylococcus aureus, Candida algicans). Rezistence laktobacilů na ATB je výhodou v případě antibiotické terapie infekce v organizmu. Kmen 16A/ 1 je rezistentní na 6 ATB, semirezistentní na 2 ATB a citlivý na 5 ATB.

Další kmeny s výbornými vlastnostmi, které by v budoucnosti mohly tvořit součást de novo tvořeného probiotika, jsou kmeny 17 A Lactobacillus crispatus (obr. 3) a 29 B Lactobacillus acidophilus (obr. 4). Oba kmeny mají obdobné vlastnosti jako kmen 16 A/ 1. Jediný podstatný rozdíl je v jejich imunomodulačních schopnostech. Tyto dva kmeny stimulují pouze fagocytární a peroxidázovou aktivitu leukocytů, aktivitu lysozymu však snižují.

Za potenciální součást nového vaginálního probiotika lze považovat i kmen 8A Lactobacillus gasseri (obr. 5), který se vyznačuje svou vysokou rezistencí vůči ATB –  je citlivý pouze na 1 ATB (tetracyklin), semirezistentní též na 1 ATB (ceftazidin), jinak vykázal rezistenci na všech zbylých 11 ATB. Vysoká rezistence na ATB tohoto kmenu by mohla být příznivě využita v přípravě vaginálního probiotika, které by sloužilo jako preventivní terapie rozvoje vaginální infekce v průběhu dlouhodobé ATB léčby při chronických infekčních onemocněních jiné etiologie.

Klíčovou otázkou zůstává optimální poměr vybraných kmenů v novém vaginálním probiotickém preparátu. V ideálním případě by nové probiotikum mohlo obsahovat všechny 4 výše popsané bakteriální kmeny, jejichž vlastnosti se vzájemně doplňují. Analýza vzájemné symbiózy kmenů bude logicky předmětem další etapy výzkumu s cílem stanovit optimální kombinace probiotických kmenů dle jejich biochemických a imunomodulačních vlastností a dalších mikrobiologických vlastností. Optimální kombinace probiotických kmenů v novém terapeutickém preparátu bude testována v druhé fázi projektu v roce 2010, v rámci klinického hodnocení vaginálního probiotika sloužícího k terapii poševních infekcí a k obnovení a stabilizaci poševního prostředí.

Závěr

Po absolvování detailního testování mikrobiologických vlastností kmenů endogenní vaginální flóry asymptomatických žen reprodukčního věku se jako nejideálnější bakteriální kmen z pohledu vitality po lyofilizaci, baktericidní a kandidacidní aktivity, produkce kyseliny mléčné, produkce peroxidu vodíku, adherence k vaginálnímu epitelu, odolnosti vůči ATB, a z pohledu imunomodulačních vlastností jeví kmen 16A/ 1 Lactobacilus fermentatum. Tento kmen má ideální imunostimulační účinky a vysokou baktericidní i kandidacidní aktivitu. Další kmeny s výbornými vlastnostmi, které by v budoucnu mohly být součástí de novo tvořeného vaginálního probiotika, jsou kmeny 17A Lactobacillus crispatus a 29B Lactobacillus acidophilus. Oba kmeny se od kmene 16 A/ 1 liší pouze ve svých imunomodulačních schopnostech. Za potenciální součást nového vaginálního probiotika lze považovat i kmen 8A Lactobacillus gasseri, který se vyznačuje svou výjimečně vysokou rezistencí vůči ATB. Tento kmen je citlivý pouze na tetracyklin, semirezistentní na ceftazidin, a současně vykázal rezistenci na všech zbylých 11 druhů ATB. Vysoká rezistence na ATB tohoto kmene by mohla být příznivě využita v přípravě vaginálního probiotika, které by sloužilo jako preventivní terapie rozvoje vaginální infekce v průběhu dlouhodobé ATB léčby při chronických infekčních onemocněních jiné etiologie.

Testování optimální kombinace probiotických kmenů endogenní vaginální flóry v terapii poševních infekcí a při obnovení a stabilizaci poševního prostředí v novém probiotickém vaginálním preparátu bude předmětem klinického hodnocení v průběhu roku 2010.

Práce řešena za podpory Ministerstva průmyslu a obchodu ČR, dotační program Impuls, FI IM5/205.

MU Dr. Renáta Krajčovičová1
prim. MU Dr. Robert Hudeček, Ph.D.1
Mgr. Marika Chrápavá2

1Gynekologicko porodnická klinika LF MU a FN Brno
2Valosun a.s., oddělení výzkumu a vývoje, Brno


Zdroje

1. Citterbart K et al. Gynekologie. Praha: Galén 2001: 110– 111.

2. Mašata J, Jedličková A et al. Infekce v gynekologii a porodnictví. Praha: Maxdorf 2004: 23– 33.

3. Cherpes TL, Hillier SL, Meyn LA et al. A Delicate Balance: Risk Factors for Acquisition of Bacterial Vaginosis Include Sexual Activity, Absence of Hydrogen Peroxide‑Producing Lactobacilli, Black Race, and Positive Herpes Simplex Virus Type 2 Serology. Sex Transm Dis 2008; 35(1): 78– 83.

4. Calzolari E, Masciangelo R, Milite V et al. Bacterial vaginosis and contraceptive methods. Int J Gynecol Obstet 2000; 70: 341– 346.

5. Krajčovičová R, Hudeček R, Chrápavá M. Faktory ovlivňující vaginální eumikrobii. Prakt Gyn 2008; 12(4): 202– 211.

6. Unzeitig V, Al Awad H. Nové možnosti stabilizace porušeného poševního prostředí. Prakt Gyn 2006; 10(5): 170– 173.

7. Chrápavá M et al. Výkumní zpráva č.3 –  Experimentální část projektu: průběh, popis, materiál, metodika, výsledky, Dotační program Impuls, č.: FI‑IM5/ 205, Ministerstvo průmyslu a obchodu, ČR.

Štítky
Dětská gynekologie Gynekologie a porodnictví Reprodukční medicína
Přihlášení
Zapomenuté heslo

Nemáte účet?  Registrujte se

Zapomenuté heslo

Zadejte e-mailovou adresu se kterou jste vytvářel(a) účet, budou Vám na ni zaslány informace k nastavení nového hesla.

Přihlášení

Nemáte účet?  Registrujte se